Identifizierung von Trenbolon -Metaboliten unter Verwendung der Massenspektrometrie des Wasserstoffisotopenverhältnisses und der Flüssigchromatographie/hoher Genauigkeit/hoher Massenspektrometrie zur Dotierungskontrollanalyse

Trenbolon ist ein synthetisches anabolisch-androgenes Steroid, das für die Leistungsverstärkung im Sport missbraucht wurde. Der Nachweis von Trenbolon-Doping in routinemäßigen Sport-Drogentestprogrammen ist komplex, da Methoden, die Gaschromatographie-/Massenspektrometrie verwenden Nur nach Erkennung. Die Anzahl der zuvor gemeldeten Metaboliten im menschlichen Urin ist begrenzt, und die meisten analytischen Methoden beruhen auf dem Ziel von Epitrenbolon, Trenbolonglucuronid und Epitrenbolonglucuronid. Um das Vorhandensein zusätzlicher Trenbolon-Metaboliten zu untersuchen und den Stoffwechsel erneut zu untersuchen, wurde eine Eliminierungsstudie durchgeführt. Eine einzige Dosis von 10 mg 5-fach deuteriertem Trenbolon wurde an einen gesunden männlichen Freiwilligen verabreicht, und 30 Tage lang wurden Urinproben gesammelt. Für die Probenverarbeitung wurden veröffentlichte Protokolle unter Berücksichtigung von unkonjugierten, glucuronsäure-, sulfo- und alkalisch-labil-konjugierten Steroidmetaboliten kombiniert. Die Strategie für die Probenpräparation bestand aus Festphasen-Extraktionen, extrakten Flüssigkeitsflüssigkeiten, Metaboliten-Dekonjugation, HPLC-Fraktionierung und Derivatisierung. Zu den analytischen Methoden gehörten Gaschromatographie/Wärmeleit-/Wasserstoff-Isotopen-Massenspektrometrie in Kombination mit einer einzelnen Quadrupol-Massenspektrometrie sowie der Flüssigchromatographie/hoher Genauigkeit/hoher Massenspektrometrie der hydrolysierten und nicht hydrolysierten Proben. Zwanzig Deuterium-markierte Metaboliten wurden identifiziert, darunter Glucuronsäure-, Sulfo- und Potential-Cystein-Konjugate, und charakterisiert durch parallele Reaktionsüberwachungsexperimente, die entsprechende Produktionenmassenspektren liefern. Hauptmetaboliten wurden Trenbolon-diol und potenziellen Trenbolon-Diketon-Derivaten zugeschrieben, die als Glucuronsäure und Sulfo-konjugierte Analyten mit Nachweisfenstern von 5 Tagen ausgeschieden wurden. Eine weitere Charakterisierung wurde mit Pseudo MS 3 -Experimenten der intakten Konjugate und durch Vergleich der resultierenden Produktionenmassenspektren mit Referenzmaterial durchgeführt.

Einführung

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Trenbolon (Tren) gehört zur Klasse synthetischer anabolisch-androgener Steroide (AAS) und wird strukturell durch eine 4,9,11-Trie-3-One-Struktur charakterisiert, die ein hochkonjugiertes π-Elektronensystem umfasst (Abbildung 1). Die signifikanten anabolen Eigenschaften von Tren, die zu einer erhöhten Muskelgröße und Stärke führen. Im Sport wurde die Verwendung von Trenbolon zu jeder Zeit von der World Anti-Doping Agency (WADA) verboten, die gemäß S1 1 kategorisiert ist. (Anabolische androgene Steroide) in der verbotenen Liste (WADA, 2020). Laut den jährlichen Statistiken der WADA sind anabolische Wirkstoffe die am häufigsten missbrauchte Substanzgruppe im Sport mit insgesamt 1.823 unerwünschten Analyseergebnissen (AAFS) im Jahr 2018. Innerhalb dieser Gruppe machen Tren -Vorkommen 6% aus (WADA, 2019). Die Statistiken können jedoch nur Fälle von nachweisbarem Tren widerspiegeln und befasst sich nicht endgültig mit der Frage, ob Tren von Nutzern von AAS weniger bevorzugt wird oder wenn verfügbare Erkennungsstrategien nicht die erforderliche analytische Rücknahme anbieten.

Abbildung 1. Strukturformeln von (EIN) Trenbolon und (B) d₅-Trenbolon für die Ausscheidungsstudie verwendet.

Aus diesem Grund bestand das Ziel dieses Projekts darin, den Stoffwechsel von Tren erneut zu untersuchen, um die Stoffwechselprodukte zu untersuchen, die möglicherweise die Erweiterung des Erkennungsfensters unterstützen. Die Anzahl der zuvor gemeldeten Tren -Metaboliten ist knapp, und für den Doping -Kontrollzweck konzentriert sich die Analyse derzeit auf die Hauptmetaboliten des menschlichen Harnwegs Epitrenbolon (Epitren), Epitrenbolonglucuronid (Epitren Glu) und Trenbolon Glucuronid (Tren Glu) (De Boer et al., 1991; Schänzer, 1996). In Bezug auf die Erkennungsfenster wurden zwei Datensätze von ungefähr 3 Tagen (Spranger und Metzler, 1991) bis 32 Tage (Sobolevsky und Rodchenkov, 2015) veröffentlicht. Neben Glucuroniden haben Sulfate (Rzeppa et al., 2015) und Cysteinkonjugate (Sobolevsky und Rodchenkov, 2015) von Tren und Epitren wurden gemeldet. Cysteinkonjugate werden durch Phase-II-Metabolismus produziert, wo das Tripeptid-Glutathion durch Glutathiontransferase kovalent gebunden wird. Im Allgemeinen sind Cysteinkonjugate unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert (Blair, 2006; Fabregat et al., 2010, 2011, 2013; Pozo et al., 2010), aber das von Sobolevsky und Rodchenkov (2015) beschriebene Cysteinkonjugat von Trenbolon (2015). Es wurde festgestellt Rodchenkov, 2015). Während In-vitro Es wurden Studien erzeugt, die mehrere monohydroxylierte Metaboliten und Trenbolon-Diketon erzeugt haben (Metzler und Pfeiffer, 2001; Kuuranne et al., 2008).

Heutzutage werden LC-MS-basierte Methoden häufig zur Analyse von Tren und seinen Metaboliten verwendet (Thevis et al., 2005a, 2009; Tudela et al., 2015) als GC-MS-basierte Methoden wurden aufgrund von Derivatisierungsartefakten und einer geringen thermischen Stabilität der Zielanalyten von begrenztem Nutzen festgestellt (de Boer et al., 1991; Ayotte et al., 1996; Casademont et al., 1996; Marques et al., 2007; Brun et al., 2011).

Für systematische Stoffwechselstudien wurde 2013 eine Methode zur Metabolitenidentifikation unter Verwendung der Massenspektrometrie des Wasserstoff -Isotopenverhältnisses entwickelt und erfolgreich angewendet (Thevis et al., 2013). Das Grundprinzip ist analog zu Stoffwechselstudien mit radioaktiv markierten Verbindungen (Sano et al., 1976). Die Verbindungen können aufgrund ihrer Isotopenmarkierung selektiv nachgewiesen werden.

Die Wasserstoffisotopenverhältnisse werden durch Gaschromatographie/Wärmeleit-/Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GC-TC-IRMs) bestimmt. Die organischen Verbindungen werden unter reduzierenden Bedingungen auf CO und N umgewandelt₂ sowie molekulare Wasserstoff (H)₂)) Die deuterierte Isotopologe HD. Nach der Ionisation wird die Erkennung erreicht m/z 2 für H 2 + und m/z 3 für HD + von Faraday Cups mit unterschiedlichen Verstärkungsfaktoren (Faktor 1000 Differenz). Da die natürliche Wasserstoffhäufigkeit durchschnittlich 99 beträgt.985% für H und 0.015% für D (Dunn und Carter, 2018) werden vergleichbare Signale für H 2 + und HD + für Proben bei natürlicher Häufigkeit erhalten, während deuterierte Verbindungen zu einem signifikanten Anstieg der Signale bei führen m/z 3. Verbindungen, die zu diagnostischen HD + -Signalen führen, werden anschließend durch Gaschromatographie/Elektronenionisation/hohe Genauigkeit/hohe Massenspektrometrie (GC-EI-HRMs) umfassend gekennzeichnet. Dieses Konzept wurde in mehreren Studien nachgewiesen (Thevis et al., 2013; Piper et al., 2016a, b, 2018, 2019).

Innerhalb dieses Projekts wurde zur weiteren Charakterisierung von Trenbolon und seinen Metaboliten nach der Analyse der GC-TC-IRMS angewendet. Zwanzig Metaboliten wurden mit einer Nachweisbarkeit von bis zu 6 Tagen identifiziert. Vier Metaboliten, die die längsten Erkennungsfenster aufweisen.

Materialen und Methoden

Chemikalien und Steroide

Trenbolon-Referenzmaterial und der interne Standard 2,2,4,6,6-d₅-Trenbolon wurde von Toronto Research Chemicals (Toronto, Kanada) und Epitrenbolon vom National Measurement Institute (Sydney, Australien) gekauft. Steroidreferenzmaterial für die HPLC-Trennung einschließlich Etio (Etiocholanolon), A (Androsteron), T (Testosteron) und PD (Schwangerediol) wurde von Sigma-Aldrich und 11 K (11-Ketoetiocholanolon), 5a (5α-Androstanediol), geliefert, und 11 K (11-Ketoetiocholanolon), 5A (5α-Androstanediol) und 5b (5β-Androstanediol) wurden aus Steraloiden (Newport, RI) erhalten. Chromabond C18 Festphasenextraktionspatronen (SPE) (500 mg, 6 ml) wurden von Macherey & Nagel (Dirren, Deutschland) und β-Glucuronidase von Escherichia coli (140 U/ml) von Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) gekauft (Mannheim, Deutschland). Ultrapure Wasser wurde von einem Barnstead ™ Genpure ™ XCAD Plus -System (Thermo, Deutschland) hergestellt. Alle Reagenzien und Lösungsmittel waren von analytischer Qualität. Acetonitril (ACN), Ameisensäure (FA), Methanol (MeOH), tert-Butylmethylether (TBME), Cyclohexan, Pyridin, Natriumhydroxid (NaOH), Schwefelsäure (H)₂SO₄), Gletscherlesesäure und Kalium-Tri-Sec-Butylborhydrid (1 m in THF) wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bereitgestellt. Essigsäureanhydrid wurde von Sigma Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) und Tetrahydrofuran (THF) von VWR (Darmstadt, Deutschland) geliefert. N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) wurde von Chemischen Fabrik Karl Bucher (Waldstetten, Deutschland) gekauft.

Ausscheidungsstudie

Eine Ausscheidungsstudie wurde durchgeführt, um den Trenbolon-Metabolismus erneut zu untersuchen. Nach schriftlicher Einverständniserklärung 10 mg 5-fach deuteriertes Trenbolon (Abbildung 1) in ultra-pure-Wasser/EtOH (80:20) gelöst, v/v) Wurde einem gesunden männlichen Freiwilligen oral verabreicht (43 Jahre, 84 kg), der in dieser Studie und für eine Auswaschzeit von mindestens 3 Monaten (alle Verbindungen), 6 Monate lang keine Medikamente oder Nahrungsergänzungsmittel verwendet hat (deuterierte Verbindungen) vor der Studie. Drei leere Proben wurden vorübergehend gesammelt, und nach Verabreichungsproben wurden bis zu 30 Tage lang gesammelt. In den ersten 48 Stunden nach Trenbolonaufnahme wurde jeder Urin gesammelt. Vom dritten Tag bis zum fünften Tag wurden zwei bis drei Urinproben pro Tag gesammelt, und danach wurde nur der erste Morgen Urin bis zum Ende der Studie untersucht. Die Verwaltungsstudie wurde vom Ethikkomitee des Nationalen Instituts von Sport in Rumänien (Bukarest, Rumänien, #2283, 2016) genehmigt.

Analyse hydrolysierter Steroide

Probenvorbereitung

Eine umfangreiche Probenvorbereitung war erforderlich, um eine angemessene Reinheit und unkomponierte Volatilität der Metaboliten für die GC-TC-IMRS-Analyse zu erreichen. Urinproben wurden nach etablierten Protokollen für die Analyse des Isotopenverhältnisses von Steroiden hergestellt. Hier ist jede Probe in vier Hauptfraktionen unterteilt: unkonjugierte Steroide, Glucuronsäure -Konjugate (Piper et al., 2008), Sulfo-Konjugate (Piper et al., 2010) und Cystein -Konjugate (Fabregat et al., 2010, 2011, 2013; Pozo et al., 2010). Anschließend werden die Fraktionen von Glucuroniden und Sulfaten durch HPLC weiter in sieben Unterfraktionen unterteilt (Thevis et al., 2013). Die Probenvorbereitung und -analyse sind in Abbildung 2 zusammengefasst.

Figur 2. Schematische Übersicht über die drei verschiedenen Probenpräparate, die in Gelb/Blau (1 ST), Pink (2 Nd) und Orange (3 Rd) gefärbt sind; Rundete Eckkästen geben die Probenverarbeitungsschritte an, Kreise geben frühere Konjugationsformen der liberierten Steroide an (frei = unkonjugierte Steroide, Gluc = Glucuronide, Schwefel = Sulfate, Cys = Cystein -Konjugate), schwarze Pfeile repräsentieren die Probentrennung durch LLE: Horizontale Pfeile repräsentieren die Verarbeitung der Rekoration reduziert die Verarbeitung der wässrigen Schicht und der vertikalen Pfeile der organischen Schicht geben rechteckige Boxen die angelegten analytischen Systeme an.

Für jede Probe war ein Volumen von 20 ml Urin erforderlich. Zunächst wurden zwei C-18-Spe-Kartuschen pro Probe mit 2 ml MeOH vor konditioniert und anschließend mit 2 ml Wasser gewaschen. Dann wurde jede Probe geteilt und 10 ml Urin wurden auf jede Patrone aufgetragen, die anschließend mit 2 ml Wasser gewaschen und schließlich mit 2 ml Meoh eluiert wurde. Beide Eluate jeder Probe wurden kombiniert und unter einem sanften Strom mit Druckluft bei 50 ° C zu Trockenheit verdampft. Nach der Verdunstung wurden die Proben mit 1 ml wässriger 0 rekonstituiert.2 m Natriumphosphatpuffer bei pH 7 und ein Schritt mit 5 ml TBME eine flüssige Flüssigkeits-Extraktion (LLE). Daher wurde die Mischung 5 Minuten lang geschüttelt und anschließend 5 min bei 600 g zentrifugiert, bevor beide Schichten getrennt wurden. Die organische Schicht ergab den Anteil der unkonjugierten Steroide (Fraktion F; frei).

Die verbleibende wässrige Schicht wurde mit 100 μl β-Glucuronidase bei 50 ° C für 1 h inkubiert. Zur Beendigung der Hydrolyse wurden 500 & mgr; l eines wässrigen 20% igen Kaliumcarbonatpuffer (pH 10) zugegeben. Um die liberierten Steroide zu extrahieren, wurde ein zweiter LLE -Schritt mit TBME durchgeführt und die resultierende organische Schicht enthielt die früheren Glucuronsäure -Konjugate (Fraktion GLUC). Dann wurde der pH -Wert der wässrigen Schicht mit Gletscher Essigsäure auf 5 eingestellt und durch SPE wie oben beschrieben gereinigt. Nach der Verdunstung wurden die Proben mit 2 inkubiert.5 ml Etoac/Meoh (70/30, v/v) und 1 ml Etoac/h₂SO₄ (100 ml/200 ng, v/w) bei 50 ° C für 1 h. Anschließend 0.5 ml methanolischer NaOH (1 m) wurden zugegeben, das Gemisch wurde wie oben beschrieben verdampft und mit 5 ml Wasser rekonstituiert. Ein drittes Lle mit TBME wurde durchgeführt, um die ehemals sulfo-konjugierten Steroide (Fraktionsschwefel) zu extrahieren. Darauf folgte die Alkalisierung der wässrigen Schicht mit 300 μl 6 m KOH und einen Inkubationsschritt bei 60 ° C für 15 Minuten. Schließlich wurden alkal-labile Steroide, die potenzielle Cysteinkonjugate umfassten, durch das letzte LLE (Fraktion Cys) extrahiert.

Die vier resultierenden TBME -Extrakte pro Probe wurden zur Trockenheit und die durch HPLC weiter gereinigten Sulfate und Sulfate verdampft. Zu diesem Zweck wurden die Proben in 100 & mgr; l ACN/H rekonstituiert₂O (50/50, v:v), und das gesamte Volumen wurde in ein Agilent 1100 HPLC-UV-System (Waldbronn, Deutschland) injiziert, das mit einer X Bridge Shield RP18-Säule ausgestattet ist (4).6 × 250 mm) mit 5 μm Partikelgröße (Wasser, Eschborn, Deutschland). UV -Signale wurden bei 195 und 360 nm übernommen. Die Gradientenelution wurde wie folgt mit einer Durchflussrate von 1 ml/min durchgeführt: Start bei 20% ACN/80% Wasser erhöhte sich der Gradient innerhalb von 25 Minuten auf 100% ACN, wurde 10 Minuten lang gehalten und 5 Minuten lang neu ausgerichtet. Mit Unterstützung eines automatischen Fraktionskollektors für Foxy R1 (Axel Semrau, Sprockhövel, Deutschland) wurden die folgenden HPLC-Unterfraktionen unter Verwendung der in Klammern gezeigten Retentionszeitmarker erzeugt. I: 3.00–10.00 min, ii: 10.01–13.50 min (Tren, Epitren), III: 13.51–14.80 min (t), iv: 14.81–17.00 min (Epit, DHEA, 5B, 5A, Etio), V: 17.01–19.50 min (PD), vi: 19.51–24.50 und vii 24.51–33.00 min (16 en).

Die eluierten HPLC-Unterfraktionen wurden zur Trockenheit verdampft. Derivatisierung aller von der HPLC-Säuberung abgeleiteten Fraktionen sowie der Fraktionen, die die Cystein-Addukte und freien Steroide enthalten.

Derivatisierungstechniken

Acetylierung

Zur Acetylierung wurden die Proben in 75 & mgr; l Pyridin und 75 μl Essigsäureanhydrid rekonstituiert und 1 h bei 70 ° C derivatisiert. Anschließend wurde das Derivatisierungsgemisch verdampft. Die Proben wurden GC-TC-IRMS/MS (Abschnitt GC-TC-IRMS/MS-Setup), GC-EI-HRMS (QTOF) (Abschnitt GC-EI-HRMS (QTOF)) und LC-ESI-HRMS (Abschnitt GC-EI-HRMS (QTOF)) und LC-ESI-HRMS unterzogen Abschnitt LC-ESI-HRMS (LC Orbitrap) Setup) Analyse.

Trimethylsilylierung

Für die Trimethylsilylierung wurden die Proben in 80 & mgr; l MSTFA rekonstituiert: NH₄: Ethanethiol (1000: 2: 3, v:w:v), inkubiert bei 60 ° C für 45 Minuten (Mareck et al., 2004, 2008) und gemessen wie in Abschnitt GC-EI-HRMS (Orbitrap) -Setup beschrieben.

Instrumentenmethoden

GC-TC-IRMS/MS-Setup

Nach der Verdampfung des Derivatisierungsgemisches wurden die acetylierten Proben in einem geeigneten Volumen von Cyclohexan (typischerweise 20 μl) für GC-TC-IRMs/MS-Analyse rekonstituiert. Die Analyse wurde an einem Delta V Plus IRMS durchgeführt, der über einen GC -Isolink -CNH für die thermische Umwandlung bei 1.450 ° C mit einem keramischen Reduktionsreaktor und Conflugen -IV zu einer Spur 1310 GC (Thermo, Bremen, Deutschland) gekoppelt wurde, gekoppelt wurde. Die chromatographische Trennung wurde in einer DB-17-MS-Säule (30 m × 0) durchgeführt.25 mm) mit einer Filmdicke von 0.25 mm. Der Temperaturgradient war wie folgt: Die Temperatur blieb bei 100 ° C für 1 konstant.5 min und erhöhte sich mit 40 ° C/min bis 240 ° C und anschließend mit 5 ° C/min bis 320 ° C mit einer Haltezeit von 2 min. Die Proben wurden im spaltlosen Modus bei 300 ° C mit einem Injektionsvolumen von 5 μl injiziert. Ein einzelner Taper -Einlass -Liner (900 & mgr; l Volumen, 4 mm Innendurchmesser, 6.47 mm Außendurchmesser, 78.5 mm Länge) mit Glaswolle aus Agilent (Teilenummer: 5190-2293) wurde verwendet. Nach dem Übergeben der GC -Säule wurde der Fluss durch ein Verhältnis von ungefähr 1:10 zu einem ISQ -Einzelquadrupol -Massenspektrometer (Thermo, Bremen, Deutschland) geteilt. Die Datenerfassung und -verarbeitung wurden mit Isodat 3 durchgeführt.0 und xcalibur 2.2 Software (Thermo, Bremen, Deutschland).

GC-EI-HRMS (QTOF) Setup

Following GC-TC-IRMS/MS analysis, the acetylated samples were diluted to a final volume of 200 μL cyclohexane and subjected to GC-EI-HRMS measurements on an Agilent 7200 QTOF system hyphenated to an Agilent 7890A gas chromatograph (Santa Clara, CA )). Das Chromatographie-Setup entsprach den oben beschriebenen GC-TC-IRMs/MS (Abschnitt GC-TC-IRMS/MS-Setup), einschließlich derselben analytischen Spalte und demselben Temperaturprogramm. Das Injektionsvolumen wurde auf 4 μl reduziert. Die Daten wurden innerhalb eines Bereichs von erfasst m/z 50–800 mit einer Erfassungsrate von 5 Spektren/s und mit Masshunter -Software (Version B) bewertet.06, Agilent). Die Massenkalibrierung wurde vor und während jeder analytischen Stapel durchgeführt.

GC-EI-HRMS (Orbitrap) Setup

Die trimethylsilylierten Proben wurden (2 & mgr; l Injektionsvolumen) in einen Q Exactive GC Orbitrap (Thermo, Bremen, Deutschland) injiziert (Thermo, Bremen). Aufgrund der unterschiedlichen Derivatisierungstechnik wurde das System mit modifizierten chromatographischen Bedingungen betrieben, die aus Routineprotokollen angepasst wurden (Thevis et al., 2011). Der GC war mit einer HP-Ultra 1-Säule (17 m × 0) ausgestattet.2 mm) von 0.11 mm Filmdicke. Das Temperaturprogramm begann bei 180 ° C und wurde mit 3 ° C/min bis 240 ° C und mit 40 ° C/min bis 320 ° C angehoben, wo es 2 min konstant blieb. Die Proben wurden im Split -Modus mit einem Split -Fluss von 5 ml/min injiziert. Der Massenbereich für vollständige MS -Experimente war m/z 50–700 und eine Auflösung von 60.000 FWHM wurden angewendet. Die Daten wurden mit Xcalibur -Software bewertet.

LC-ESI-HRMS (LC Orbitrap) Setup

Für LC-ESI-HRMS-Messungen wurden die acetylierten Proben verdampft und mit 100 & mgr; l ACN/H rekonstituiert₂O (50:50, v/v) mit 0 angesäuert.1% fa. Ein Vanquish UHPLC (Thermo, Bremen, Deutschland) mit einem Poroshell 120 EC-C8 (2) ausgestattet.7 & mgr; m, 3 × 50 mm) (Agilent, Santa Clara, CA) wurde zu einem q exactive hf-x (Thermo, Bremen, Deutschland) beigetragen. ACN- und Ultratwasser -Wasser enthält beide 0.1% FA wurden als Lösungsmittel eingesetzt, und die Durchflussrate wurde auf 400 μl/min eingestellt. Ein Volumen von 5 μl wurde pro Probe injiziert. Der LC-Gradientenlauf war wie folgt: Beginn. MS -Experimente umfassten einen vollständigen Scan (m/z 200–800), AIF (alle Ionen -Fragmentierung) und PRM im positiven Ionisationsmodus bei einer Auflösung von 60.000 FWHM. Für PRM -Experimente wurde das Isolationsfenster auf eingestellt m/z 0.4 und in der HCD-Zell der höherergetischen Kollisionsdissoziation (HCD) wurden Kollisionsenergien von 20, 30, 35 oder 40 EV angewendet. Für Pseudo MS 3 -Experimente wurde die Quelle -induzierte Dissoziationsenergie (SID) auf 20 eV eingestellt.

Analyse von konjugierten Steroiden

Für die Analyse intakt konjugierten Steroiden wurden die Proben 1: 1 mit ultralem Wasser verdünnt. Um PRM-Experimente durchzuführen, wurden ausgewählte Proben mit SPE 5-fach vorkonzentriert, wie in Abschnitt 2 beschrieben.3.1 und rekonstituiert in 50 μl 10% wässrigen ACN. Das Setup für das LC-ESI-HRMS (Orbitrap) -System war den Einstellungen ähnlich. Ab 1% ACN (enthält 0.1% FA), der Gradient stieg innerhalb von 9 min auf 40% ACN auf 99% bis 10.9 min und auf 1% bis 11 min. Das System wurde 3 Minuten lang neu ausgleichte. Vollständige MS-, AIF- und PRM -Experimente wurden durchgeführt und ESI mit positiver Polarität wurde angewendet. In ausgewählten Experimenten wurde auch eine negative Ionisation verwendet, was in den entsprechenden Datensätzen explizit angegeben ist.

Synthese von Trenbolon-diol

Trenbolon-Diol wurde durch Reduktion von Tren unter Argonatmosphäre synthetisiert. Bis 10 mg Tren, gelöst in 10 ml wasserfreiem THF. Nach 15 Minuten wurde die Reaktion mit 10 ml Ultratwasser gestoppt, und anschließend wurde ein Lle mit 20 ml TBME durchgeführt. Ein Aliquot der ausgebildeten Produkte wurde wie in der Abschnitt Acetylierung beschrieben acetyliert.

Resultate und Diskussion

Metabolitenidentifikation mit GC-TC-bestätigt

Die Verwendung von GC-TC-IRMs ermöglicht umfassende Metabolitenstudien, insbesondere bei der Untersuchung von Biotransformationsprodukten deuterierter Verbindungen.

Ein signifikanter Anstieg des Verhältnisses m/z 3 bis m/z 2 zeigt die Vorhandensein Metaboliten der verabreichten Substanz an, in diesem Fall Trenbolon. Exemplarische GC-TC-bestätigt Chromatogramme sowohl einer Vor- als auch nach der Verabreichung nach der Verabreichung sind in Abbildung 3 angezeigt. Der obere Teil (a) zeigt das Chromatogramm der Fraktion, die die hydrolysierten Glucuronide (Fraktionsgluc) einer vorübergehenden Verabreichungsprobe mit Deuteriumspiegel bei natürlicher Häufigkeit enthält. Im Gegensatz dazu zeigt das untere Chromatogramm (b) eine 45-stündige Probe nach der Verabreichung von Arzneimitteln-und mehrere Peaks deuterierter Moleküle, die Metaboliten von Tren entsprechen. Im Einschub werden Details der Metaboliten, die zu Retentionszeiten zwischen 1108 und 1110 s eluiert werden, gezeigt.

Figur 3. Gc-tc-bestätigt Chromatogramme der HPLC-Fraktion II GLUC eines PRE- (EIN) und 45 h Post- (B) Verabreichungsprobe nach Einnahme von 10 mg D gesammelt₅-Tren.

Trenbolon-Metaboliten, die durch LC-ESI-HRMs identifiziert wurden

Ausgewählte HPLC-Fraktionen, die Signale deuterierter Verbindungen von beträchtlichem Häufigkeit aufweisen, wurden zusätzlich durch LC-ESI-HRMs (/ms) analysiert. Für die Metabolitenidentifikation wurden Massen-zu-lade-Verhältnisse von berechnet von in Silico Die Vorhersage und ihre Anwesenheit oder Abwesenheit wurden in den Proben nach der Verabreichung bewertet. Vielversprechende Metaboliten, ihre entsprechenden HPLC (Sub-) Brüche, Retentionszeiten für LC-ESI-HRMs, exakte Massen, berechnete Elementarzusammensetzungen, Ausscheidungsformen und Nachweisfenster sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die erhaltenen Elementzusammensetzungen wurden innerhalb eines maximal zulässigen Massenfehlers von ± 4 ppm berechnet. Metaboliten wurden in HPLC-Unterfraktionen I, II, IV und V bestimmt. Die Zahlensequenz entspricht zunehmende Retentionszeiten und die Verringerung der Polarität der Metaboliten nach der Hydrolyse, jedoch vor der Acetylierung.

Tabelle 1. Deuterierte Tren-Metaboliten und diagnostische Produktionen (CE = 20 und CE = 30 EV) nach Hydrolyse von Phase-II.

Insgesamt wurden insgesamt 20 Phase-II-Metaboliten relevanter Rückverfolgbarkeit identifiziert. Es wurde festgestellt. Die Entkonjugation unter alkalischen Bedingungen ist für den menschlichen Stoffwechsel weniger etabliert, wurde jedoch bereits in vorbeugenden Dopingforschung zur Erzeugung von Cysteinkonjugaten bewertet (Fabregat et al., 2010, 2013; Pozo et al., 2010; Gomez et al., 2014). Besonders für Tren sollen Cysteinkonjugate von Relevanz sein (Sobolevsky und Rodchenkov, 2015).

Vermutete Phase-I und umgekehrt. Die meisten Metaboliten wurden als 4-fach deuterierte Isomere der Metaboliten identifiziert, obwohl 5-fach deuterierte Tren verabreicht wurde. Dies deutet darauf hin, dass eine metabolische Umwandlung überwiegend innerhalb des steroidalen A- oder B -Rings auftritt. Die 5-fach deuterierten Isomere des bekannten Glucuronsäure-konjugierten Metaboliten Tren (Metabolit 4) und Epitren (Metabolit 3) wurden in der jeweiligen Gluc-Fraktion bestätigt und wurden im Vergleich zu Referenz eindeutig identifiziert Material.

Für Sport -Drogentests sind insbesondere langfristige Metaboliten mit verlängerten Erkennungsfenstern von großem Interesse. Innerhalb dieser Studie wurde festgestellt. Extrahierte Ionenchromatogramme (EIC) mit Metabolit 9_gluc in vor- und nach der Verabreichungsproben sind in Abbildung 4 dargestellt. Die hydrolysierten Metaboliten 7 (ausgeschieden als Glucuronid) und 8 (ausgeschieden als Sulfat) werden aufgrund ihrer identischen Elementzusammensetzung und ihres geringfügigen Unterschieds in der Retentionszeit als Isomere angesehen. Da Metabolit 7/8 und Metabolit 9 in zwei Konjugationsformen, insbesondere als Glucuroniden und Sulfate, ausgeschieden werden, wurden sie zur weiteren Charakterisierung ausgewählt (siehe Abschnittsproduktionionenmassenspektren).

Figur 4. EIC von m/z 273.1787.

Metabolitencharakterisierung

Produktionenmassenspektren

Neben genauen Massenmessungen zur Überprüfung des Deuteriumgehalts wurden alle identifizierten Metaboliten durch Produktionenmassenspektren (MS 2) gekennzeichnet, die aus PRM -Experimenten erhalten wurden. Die Analyse wurde im ESI -positiven Modus durchgeführt, da festgestellt wurde, dass sie im Vergleich zu denen, die nach negativer Ionisation erhalten wurden., 2015). Kollision induzierte Dissoziation (CID) wurde bei verschiedenen Kollisionenergien im Bereich von 20 bis 40 EV erreicht.

Das PRM -Massenspektrum von Metaboliten 9_G nach Hydrolyse und Acetylierung ist in Abbildung 5 als Beispiel dargestellt, wobei die diagnostischen Produktionen, Elementarzusammensetzungen und Massenfehler der anderen Metaboliten in Tabelle 1 aufgeführt sind. Aus der Elementarzusammensetzung und den MS/MS-Experimenten wurden Metabolitenstrukturen postuliert. Metabolit 5 wird vorläufig einem Hydroxylmetaboliten von Tren zugeordnet, der durch den 2-fachen Verlust einer Acetyleinheit begründet wurde [neutraler Verlust von m/z 42 (ac) und m/z 60 (ACOH)]. Für diesen Metaboliten ist zusätzlich die Erzeugung einer vierten Doppelbindung durch Oxidation eines tertiären Kohlenstoffatoms erforderlich.

Abbildung 5. PRM -Massenspektrum von m/z 273.1787 bei 35 eV, die Metaboliten 9_gluc nach Hydrolyse und Acetylierung durch LC-HRMS repräsentiert.

Die Metaboliten 7 und 8 werden vorläufig Derivaten von Tren zugeordnet, die sich aus der Reduktion der 3-Oxo-Funktionalität des anabolen Steroids ergeben, wie durch die charakteristischen und wiederholt auftretenden Verluste von Acetyleinheiten gestützt wird. Ferner wird das Vorhandensein von zwei zusätzlichen Doppelbindungen (von unbekannter Position) postuliert.

Die elementare Zusammensetzung von Metabolit 9 zeigt eine mögliche metabolische Umwandlung in Trenbolon-Diketon an. Der Metaboliten wurde nicht durch Pyridin/Essigsäureanhydrid Derivatisiert, was das Fehlen von Hydroxylfunktionen bestätigt. In Übereinstimmung mit dem aktuellen Wissenszustand werden freie Hydroxylgruppen unter den angewandten Bedingungen acetyliert, die -oxo -Funktionen sind jedoch nicht betroffen; Eine fehlgeschlagene Derivatisierung aufgrund einer sterischen Hinderung kann jedoch nicht ausgeschlossen werden (Piper et al., 2008).

Der Nachweis von Trenbolon-Diketon, auch als 17-Keto-Trenbolon oder Trendion bekannt, wurde bereits 1991 gemeldet (Spranger und Metzler, 1991) für In vivo Proben und die Verbindung könnte erzeugt werden in vitro durch die gleiche Gruppe unter Verwendung menschlicher Lebermikrosomen (Metzler und Pfeiffer, 2001).

Bemerkenswert, ein zusätzliches reichlich vorhandenes Signal von m/z 97.0652 entsprechend C₆H₉O als Elementarzusammensetzung (± 4.2 ppm) wurde in den PRM -Spektren beobachtet. Da Trenbolon-Diketon im A- und B-Ring deuteriert ist, muss das Signal vom steroidalen C- oder D-Ring abgeleitet werden. Die strukturelle Erklärung des äquivalenten diagnostischen Ion wurde für Steroide von Androst-4-EN-3-Einen erreicht, aber diese Struktur kann nicht sofort auf das hier untersuchte Molekül übertragen werden et al., 2012).

Synthese von Trenbolon-diol

Für die Metaboliten 7_gluc und 8_sulf, die vorgeschlagen wurden, um Trenbolon-Diol-Derivate darzustellen, wurden weitere eingehende Studien durchgeführt. Um ein Referenzmassenspektrum von Trenbolon-Diol zu erhalten. Zwei Isomere von Trenbolon-Diol wurden erfolgreich synthetisiert und PRM-Spektren der freien und acetylierten Formen erworben. Bemerkenswerterweise wurden auch 1-fach und 2-fach dehydrogeniertes Trenbolon-Diol-Derivate als Nebenprodukte in zwei isomeren Formen erhalten. Es wurde festgestellt. In Abbildung 6 wird das EIC des synthetisierten 2-fach dehydrogenierten Trenbolon-Diol-Derivats (A) mit den in den Urinproben nach der Verabreichung identifizierten Metaboliten verglichen (b). Die Retentionszeiten (4.85 und 4.95 min) der synthetisierten Produkte entsprechen den postulierten Metaboliten. Beide synthetisierten Isomere waren im Glucuronid und in der Sulfatfraktion vorhanden. Während der Metabolit bei 4.95 min ist das bekannteste Isomer, das als Glucuronid eliminiert wurde, das sulfatierte Analogon mit dem längsten Erkennungsfenster bei 5.03 min wurde nicht synthetisiert. Die potenziellen Cysteinkonjugate sind aufgrund ihres kurzen Erkennungsfensters weniger wertvoll.

Abbildung 6. EIC von m/z 353.1747 (± 5 ppm), die die 2-fachen dehydrogenierten Trenbolon-Diol-Derivate darstellen m/z 357.1998 (± 5 ppm), die die deuterierten Metaboliten 7/8 darstellen.

Produktionenmassenspektren des acetylierten 2-fachen dehydrogenierten Trenbolon-Diol-Derivatisomers bei 4.95 min und der acetylierte Metabolit 7_GLUC nach der Hydrolyse stimmen gut überein, wie in Abbildung 7 gezeigt. Die beobachtete Massenverschiebung von vier DA wird durch die 4-fache Deuteration des Metaboliten verursacht. Die PRM -Massenspektren der drei hydrolysierten Metaboliten waren in allen Ausscheidungsformen sehr vergleichbar. Infolgedessen wird angenommen. Isomere können sowohl Stereozentren in C3 als auch C17 sowie verschiedenen Positionen der zusätzlichen Doppelbindungen zugeordnet werden.

Abbildung 7. PRM -Massenspektrum von (EIN) m/z 357.1995 bei 40 eV, die den deuterierten Metaboliten 7_gluc nach Hydrolyse und Acetylierung und darstellen (B) m/z 353.1747 bei 40 eV, die die synthetisierten 2-fach dehydrogenierten Trenbolon-Diol-Derivate bei 4 darstellen.95 Minuten von LC-ESI-HRMs.

Phase-II-Konjugate

Die Probenpräparation, die SPE, LLE, Hydrolyse, HPLC -Fraktionierung und Derivatisierung umfasst., 2019). Darüber hinaus ist der hierin verwendete Ansatz zur Analyse von acetylierten Steroiden durch LC-ESI-HRMs sicherlich unkonventionell.

Bei Sport -Drogentests ist die Implementierung neuer Analyten/Metaboliten in vorhandene Methoden von großer Bedeutung, um einen spezifischen und empfindlichen Nachweis der Zielmoleküle sowie angemessene Erkennungsfenster zu ermöglichen. Derzeit werden drei verschiedene Methoden routinemäßig für die Analyse von Doping-Kontrollproben verwendet, bei denen eine Implementierung neuer Tren-Metaboliten möglich erscheint: (a) Messung von Analyten hydrolysiert und als TMS-Derivate mit GC-EI-MS/ms Derivatisierten Messung hydrolysierter, aber nicht acetylierter Analyten (c) Messung von intakten Phase-II-Metaboliten mit LC-ESI-HRMs. Da die Ionisationseffizienz von Steroiddiolen mit niedriger Protonenaffinität wie Metaboliten 7/8 durch ESI normalerweise begrenzt ist, wurde der vorhandene LC-ESI-HRMS-Ansatz nicht als bevorzugte Option angesehen. Bei Verwendung von LC-ESI-HRMs ist es im Allgemeinen ratsam, die intakten Phase-II-Konjugate zu messen, was auch zu einer verringerten Arbeitsbelastung führt (Gomez et al., 2014).

Um die neuen Metaboliten hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit auf Dotierung von Routine-Tests zu untersuchen, wurden die intakten Phase-II-Metaboliten durch LC-ESI-HRMS analysiert. Für die potenziellen Tren-Diol-Derivate (Metabolit 7_gluc) wurde ein Peak identifiziert. Die Pseudo MS 3 -Massenspektren des intakten Glucuronids und des acetylierten und hydrolysierten Metaboliten werden in 8 verglichen. Beide Produktionenmassenspektren abgeleitet von m/z 273.1787 stimmen gut überein. Beobachtete Variationen der relativen Intensitäten werden möglicherweise durch Unterschiede im energetischen Status beider Moleküle verursacht, die sich aus dem In-Source-Dissoziationsprozess ergeben.

Abbildung 8. Pseudo MS 3 Massenspektren von (EIN) m/z 449.2108 → 273.1787, die den glucuronidierten Metaboliten 7_gluc und darstellen (B) m/z 357.1995 → 273.1787, die den Metaboliten 7_gluc nach Hydrolyse und Acetylierung bei SID = 20 eV und CID = 30 eV darstellen.

Vergleich mit Referenzmaterial

Wie in oben beschrieben, ergab die Charakterisierung von Metabolit 9 ein potenzielles Diketonderivat von Trenbolon. Ein im Handel erhältlicher Referenzstandard von Trenbolon-Diketon, 4,9,11-Estratrien-3,17-Dione, wurde von LC-ESI-HRMS analysiert. Das Pseudo MS 3 -Spektrum des sulfatierten Diketonmetaboliten im Urin und das Produktionenmassenspektrum des Referenzstandards sind in Abbildung 9 dargestellt. Auch hier wird die Massenverschiebung von vier DA durch die 4-fache Deuteration des Metaboliten verursacht. Die gute Übereinstimmung beider Produktionenmassenspektren unterstützt die Zuordnung von Metabolit 9_Sulf zu einem potenziellen Diketonderivat. Es fällt auf, dass die Phase-II-Konjugation über den Keto-/Enol-Tautomerismus auftritt, wie bereits für Androstenedion beschrieben (Tajic und Kovacic, 1968; Goodall und James, 1979, 1981).

Abbildung 9. (EIN) Pseudo MS 3 -Massenspektrum von m/z 353.1355 → 273.1787 bei SID = 20 eV und CID = 30 eV, die den sulfatierten Metaboliten 9_Sulf und darstellen (B) PRM -Massenspektrum von m/z 269.1536 bei 30 eV, die Trenbolon-Diketon-Referenzmaterial darstellt.

Bestimmung der Erkennungsfenster für veröffentlichte langfristige Metaboliten

Die hochkarätigen Routine-Doping-Kontrollmethoden basieren hauptsächlich auf Epitrenbolon, Trenbolonglucuronid und Epitrenbolonglucuronid (de Boer et al., 1991; Schänzer, 1996; Brun et al., 2011). Darüber hinaus wurden Trenbolonsulfat und das Trenbolon -Cystein -Addukt veröffentlicht (Rzeppa et al., 2015; Sobolevsky und Rodchenkov, 2015). Während noch keine Erkennungsfenster für das Sulfatkonjugat beschrieben wurden, stehen für das Glucuronid -Konjugat begrenzte Datensätze zur Verfügung. Eine frühe Tren -Stoffwechselstudie verwendete radioaktive Kennzeichnung und untersuchte die Urinausscheidung. Spranger und Metzler entdeckten 54% der Radioaktivität innerhalb von 26 Stunden und 63% innerhalb von 72 Stunden nach der Tren -Verabreichung, was auf eine schnelle Eliminierung hinweist (Spranger und Metzler, 1991). Eine Veröffentlichung des ehemaligen russischen Anti-Doping-Labors veröffentlichte die Rückverfolgbarkeit von Trenbolonverwaltungen von 32 Tagen, wenn sie Epitrenbolon-Glucuronid als Zielanalyte einsetzten; In ähnlicher Weise wurde das Trenbolon -Cystein -Addukt für 32 Tage nachgewiesen. Die deuterierten Analoga der beschriebenen Metaboliten wurden auch in dieser Eliminierungsstudie nachgewiesen, wie in Abbildung 10 durch die jeweiligen EIC dargestellt.

Abbildung 10. EIC von (EIN) m/z 452.2327 (± 5 ppm), die deuterierten Trenbolonglucuronid darstellen, (B) m/z 354.1429 gegen deuteriertes Trenbolonsulfat und (C) m/z 276.2006 repräsentiert deuteriertes Trenbolon-Cystein-Addukt durch LC-HRMS.

Epitrenbolon war 45 Stunden und Tren nach oraler Verabreichung von 10 mg Trenbolon für 21 Stunden nachweisbar. Für das Sulfatkonjugat wurden drei potenzielle Isomere identifiziert, von denen zwei offensichtlich durch Epimerisierung an Position 17 induziert werden. Die dritte blieb unklar, könnte aber einem konjugierten Konjugat zugeordnet werden, der an Position 3 gerichtet war. Dies kann aus dem Auftreten der oben beschriebenen angenommenen Konjugation der Diketonderivate Metabolit 9_gluc und 9_sulf abgeleitet werden, die über eine steroidale Ketogruppe konjugiert zu sein scheinen. Alle drei Isomere waren 45 Stunden nach der Verabreichung nachweisbar. Das Tren Cystein -Konjugat wurde 45 Stunden lang beobachtet m/z 276.2006 bezog sich auf die Steroidstruktur, die durch die Dissoziation der Quelle erzeugt wird. Der intakte Phase-II-Metaboliten bei m/z 397.2204 war ebenfalls sichtbar, aber für Abbildung 10 wurde das Massenverhältnis der Variante mit der längsten Nachweisbarkeit gewählt.

Die in dieser Studie generierten Ergebnisse bestätigen die primären Daten von Spranger und Metzler, wobei Tren als Substanz mit einer schnellen Eliminierung identifiziert wurde. Inter-Individuelle Unterschiede im Stoffwechsel der Freiwilligen der verschiedenen Studien sind eine denkbare Erklärung für abweichende Ergebnisse, aber die Untersuchung einer größeren Bevölkerung scheinen notwendig und gerechtfertigt zu sein, um die Beobachtungen weiter zu begründen.

Einschränkungen der Kombination von Daten, die von GC-TC-IRMS/MS, LC-ESI-HRMS und GC-EI-HRMS erhalten wurden

In früheren Veröffentlichungen wurde GC-TC-IRMS/MS erfolgreich zur Unterstützung der steroidalen Metabolitenidentifikation eingesetzt, insbesondere in Kombination mit GC-EI-HRMs (Thevis et al., 2013; Piper et al., 2016a, b, 2018, 2019).

Dieses Konzept wurde an diese Studie angepasst und in Abbildung 3 wurden zwei Metaboliten unter Verwendung des konventionellen Ansatzes identifiziert. Der erste Peak bei 1108 s wurde als Glucuronsäure-Konjugat des gut charakterisierten Metaboliten-Epitren identifiziert, indem das Retentionszeit und das Massenspektrum mit Referenzmaterial verglichen werden. Der Metabolit nach 1110 s war früher unbekannt und kennzeichnet weiter durch GC-EI-HRMS (TOF) -Analyse (TOF). Das resultierende Massenspektrum ist in Abbildung 11 dargestellt. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Ionisations- und Dissoziationsmechanismen entspricht dieses Massenspektrum dem des deuterierten 2-fachen dehydrogenierten Trenbolon-Diol-Derivats, das durch LC-ESI-HRMs gekennzeichnet ist (Abbildung 7) (Abbildung 7).

Abbildung 11. GC-EI-HRMS Full MS-Massenspektren von Trenbolon-Diol-Metaboliten, die als Glucuronide ausgeschieden wurden (7_gluc).

Leider konnte der beschriebene Ansatz nicht auf alle Metaboliten angewendet werden. Die Qualität der analytischen Daten, die vom GC-TOF-System erzeugt wurden., 2013; Piper et al., 2016a, b, 2018, 2019).

Daher ein GC -Orbitrap -System mit einem alternativen Ionenquelle -Design, das höhere Häufigkeit von Ionen mit größerem Vorgang bevorzugt m/z Die Werte wurden verwendet, und die gemessenen TMS-Derivate zeigten im Vergleich zu Acetaten eine verringerte In-Source-Fragmentierung (Piper et al., 2018, 2019). Darüber hinaus wird routinemäßig die Trimethylsilylierung von steroidalen Analyten verwendet, wodurch eine Plattform zur Implementierung potenzieller neuer Zielanalyten in Sportdrogentestmethoden angeboten wird. Die Analyse von TMS -Derivaten mit dem GC -Orbitrap blieb jedoch eine Herausforderung, da die Referenzmaterial von Trenbolon, Epitrenbolon und D analysiert₅-Trenbolon, das als TMS-Derivate eingeführt wurde. Folglich konnten keine nicht gemeldeten Metaboliten identifiziert werden. Für die TMS -Derivate von Trenbolon und Epitrenbolon, ein Signal bei m/z 414.2405, die das molekulare Ion repräsentieren, wird erwartet. Darüber hinaus Peaks bei m/z 412.2248 und m/z 410.Es wurden 2092 berichtet, die zu Produkten gehören., 1991; Ayotte et al., 1996). Wie in 12 gezeigt, wurden im Referenzmaterial mehrere zusätzliche Peaks unbekannter Herkunft beobachtet, was auf einen signifikant begrenzten Nutzen dieses Setups hinwies, um zusätzliche Metaboliten im Urin zu identifizieren.

Abbildung 12. GC-EI-HRMS Volles MS-Chromatogramm des Epitrenbolon-Referenzmaterials als TMS-Derivate.

Es muss berücksichtigt werden, dass das hier untersuchte Molekül schlechte gaschromatographische Eigenschaften besitzt, und die hoch konjugierte 4,9,11-Trie-3-One-Struktur führt zu Derivatisierungsartefakten mit geringer thermischer Stabilität. Andere strukturell verwandte Moleküle wie der Designer-Steroid-Tetrahydrogestrioner sind im Urin auch als TMS-Derivate nachweisbar und blieben bis zu seiner ersten Identifizierung als leistungssteigernde Medikament im Jahr 2003 durch LC-MS/MS verborgen (Catlin et al., 2004; Thevis et al., 2005a). Mit anderen Worten, Tren hat eine dokumentierte Geschichte herausfordernder Analysen, die durch eine Vielzahl von bewerteten Derivatisierungstechniken bestätigt wurde (de Boer et al., 1991; Ayotte et al., 1996; Casademont et al., 1996; Marques et al., 2007; Brun et al., 2011; Parker et al., 2012).

LC-ESI-MS wurde als geeignet für die Quantifizierung von Tren (Thevis et al., 2005a, b, 2009) in der Vergangenheit und gemeinsame Routine-Doping-Kontrollverfahren heutzutage verwenden LC-ESI-MS/MS für Analyten dieser und verwandten Struktur. Infolgedessen wurde auch hier ein LC-ESI-HRMS-System verwendet, um die Einschränkungen in Bezug auf die Massenauflösung und das Vorhandensein des Molekularionen. Darüber hinaus verbesserte eine Derivatisierung durch Acetylierung die Protonenaffinität für den ESI-positiven Ionisationsmodus, insbesondere die Ionisierung des Metaboliten des Trenbolon-Diol-Derivats als stark erhöht.

Der Vorteil des nicht zielgerichteten GC-TC-IRMS-Ansatz.

Fazit

Um die Nachverdienung und Sensibilität von analytischen Ansätzen zu verbessern, die auf Trenbolonmissbrauch im Sport abzielen, ist eine umfassende In vivo Stoffwechselstudie wurde durchgeführt. Ein Ansatz, bei dem stabile Isotopen-markierte Substrate verwendet werden, die die Untersuchung von Biotransformationen durch GC-TC-IRMs erleichtert. Während sich die Strategie in früheren Studien als unkompliziert erwies, präsentierten Trenbolon und ihre Stoffwechselprodukte aufgrund ihrer begrenzten Kompatibilität mit der Gaschromatographie vergleichsweise herausfordernde Zielanalyten. Durch die Verwendung verschiedener Derivatisierung und Chromatographie wurden jedoch insgesamt 20 Metaboliten identifiziert. Es wurde festgestellt. Eine weitere Charakterisierung dieser Metaboliten wurde durch Pseudo-MS 3-Experimente und Vergleich mit kommerziell erhältlicher oder im Haus synthetisierter Referenzmaterial durchgeführt. Um den tatsächlichen Mehrwert der hier identifizierten Trenbolon -Metaboliten für routinemäßige Doping -Kontrollen zu überprüfen oder zu fälschen. Wenn ein positiver Beitrag beobachtet wird, werden zukünftige Studien zur Bestätigung vorläufig zugewiesener Strukturen e.g., Durch die Analyse der nuklearen Magnetresonanzanalyse nach der Hochskalierung der Synthese und eine Verabreichungsstudie mit nicht markiertem Trenbolon könnte gerechtfertigt sein. Darüber hinaus könnte es von Interesse sein, andere Trenbolondosen zu verwalten und eine größere Bevölkerung zur Untersuchung interindividueller Variationen zu untersuchen.

Datenverfügbarkeitsanweisung

Die für diese Studie generierten Datensätze sind auf Anfrage für den entsprechenden Autor verfügbar.

Ethikaussage

Die Verwaltungsstudie mit einem menschlichen Teilnehmer wurde vom Ethikkomitee des Nationalen Instituts für Sport in Rumänien (Bukarest, Rumänien, #2283, 2016) nach der Erklärung von Helsinki genehmigt. Die Einverständniserklärung wurde vom Freiwilligen eingeholt.

Autorenbeiträge

MT und TP konzipierte Konzeption und Studiendesign, trugen zur Dateninterpretation und -diskussion bei und überarbeitet und bearbeitet das Manuskript. Der Abgeordnete führte die Probenvorbereitung, Messungen, Datenbewertung durch und schrieb den Entwurf des Manuskripts.

Finanzierung

Dieses Projekt wurde finanziell vom Manfred-Donike Institute for Dope Analysis (Köln, Deutschland) und der World Anti-Doping Agency (Grant #17A31MT) unterstützt.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Anerkennung

Die Autoren erkennen gerne den Beitrag von Dr. Andreas Thomas, Dr. Josef Dib und das rumänische Doping -Kontrolllabor für analytische und administrative Unterstützung.

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Der Vis, m., Piper, t., Horning, s., Juchelka, d., und Schänzer, w. (2013). Wasserstoffisotopenverhältnis-Massenspektrometrie und hochauflösende/hohe Genauigkeitsmassenspektrometrie in Metabolitenidentifikationsstudien: Nachweis von Zielverbindungen für Sportdrogentests. Schnelle Kommunikation. Massenspektrom. 27, 1904–1912. doi: 10.1002/RCM.6648

Tudela, e., Deagenter, k., Geldof, l., und van Eenoo, p. (2015). Harnwegserkennung von konjugierten und unkonjugierten anabolischen Steroiden durch verdünnte und schuhe Flüssigkeitchromatographie-hohe Massenspektrometrie. Drogentest. Anal. 7, 95–108. doi: 10.1002/dta.1650

WADA (2020). Die 2020 verbotene Liste. Welt-Anti-Doping-Agentur. Online verfügbar unter: https: // www.Wada-Aama.org/sites/default/file/wada_2020_english_prohibited_list_0.PDF (abgerufen am 17. Februar 2020).

Schlüsselwörter: Gaschromatographie-Thermalumwandlungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GC-TC-IRMS), Flüssigchromatographie Hochauflösende Massenspektrometrie (LC-HRMS), Human Metabolismus, Steroide, Phase-II testen, In vivo Stoffwechsel

Zitat: Putz M, Piper T und die Identifizierung von Trenbolon -Metaboliten unter Verwendung der Massenspektrometrie des Wasserstoff -Isotopenverhältnisses und der Massenspektrometrie der Flüssigkeitchromatographie/hoher Genauigkeit/hoher Auflösung für die Doping -Kontrollanalyse Identifizierung von Trenbolon -Metaboliten. Vorderseite. Chem. 8: 435. doi: 10.3389/fchem.2020.00435

Empfangen: 28. Februar 2020; Angenommen: 27. April 2020;
Veröffentlicht: 20. Mai 2020.

Alberto Salomone, Universität Turin, Italien

Benjamin l. Oyler, Impfstoffforschungszentrum (NIAID), USA
Roberta Risoluti, Sapienza Universität von Rom, Italien

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